A chi sono rivolti questi test:

Il test può essere eseguito da tutte le donne che siano almeno alla 10ima settimana di gestazione. Esso può essere svolto da tutte le donne che siano in una gravidanza singola o gemellare, monocoriale o bicoriale, sia derivanti da un concepimento naturale che attraverso fecondazione assistita, omologa o eterologa. Tali test possono essere eseguiti da donne che già hanno portato a termine precedenti gravidanze o anche gravidanze che siano esitate in aborti (spontanei o volontari). In tal caso, è necessario farlo presente al momento della consulenza poichè il DNA libero circolante può rimanere nel circolo materno anche alcune settimane dopo la perdita del feto. necessario, altresì, riportare se la gravidanza nasce come gemellare e nel corso della stessa viene perso uno dei due feti: in tal caso la gravidanza verrà considerata come gemellare, dal momento che potrebbe essere ancora libero il DNA del secondo feto nel flusso ematico materno.

 

Caratteristiche del test

I test KARYON, BIOKARYO, MICROBIOKARYO sono test di screening che si basano sull’analisi diretta del DNA fetale circolante nel sangue materno. Tali test si distinguono dai test di screening del primo e secondo trimestre poichè questi ultimi si basano su valutazioni statistiche basate su parametri biochimici materni, ecografici e sull’età della gestante e la loro accuratezza si aggira sull’80-85%.

I test KARYON, BIOKARYO, MICROBIOKARYO presentano invece una accuratezza molto elevata. Possiedono infatti un elevato valore predittivo positivo, VVP, che implica che i risultati di falsi positivi siano ridotti al minimo ed un elevato valore predittivo negativo, che implica che i risultati di falsi negativi siano ridotti al minimo.

I test KARYON, BIOKARYO, MICROBIOKARYO si basano sull’analisi del DNA fetale libero circolante (cffDNA) nel sangue materno e tale parametro è il primo ad essere rilevato dal software che effettua l’analisi. Tale DNA si presenta sotto forma di frammenti derivanti dall’apoptosi degli epiteli materni, attraverso i quali viene liberato sia DNA materno che fetale e quest’ ultimo è definito DNA fetale libero circolante. La sua percentuale può variare tra <4%, concentrazione non utile per poter eseguire l’analisi, e circa il 40%.

Per poter eseguire l’analisi, dunque, tale valore deve essere al di sopra di un certo cut off, che viene fissato ad un valore minimo del 4%. Al di sotto di tale parametro il software dichiara una non idoneità del campione dal momento che a concentrazioni molto basse potrebbe esservi una maggiore probabilità di falsi negativi.

La concentrazione del DNA fetale libero circolante dipende da un insieme di fattori di derivazione materna, prima di tutti l’epoca gestazionale. Come riportato in alcuni lavori scientifici (Wapner 2015), l’epoca migliore per eseguire il prelievo di sangue è intorno alla 12esima settimana di gravidanza, periodo intorno al quale la concentrazione di DNA fetale libero risulta essere soddisfacente (circa il 10%). È necessario sottolineare che tale parametro varia di gravidanza in gravidanza e varia nel corpo della donna nel corso della stessa gravidanza.

 

(Wapner,2015)

La metodica

I test si basano su una metodica innovativa che segue un ben definito e controllato workflow. A partire dai frammenti di DNA estratto, tale metodica consente la preparazione di librerie genomiche che vengono poi sottoposte a sequenziamento di ultima generazione ad alta risoluzione (Next Generation sequencing – NGS) dell’intero genoma ed analisi attraverso Software che applicano stringenti criteri e forniscono analisi dei dati per ciascuna paziente.

I software utilizzano algoritmi di analisi multi-core ad alta risoluzione che consente di avere un numero di letture che va da 60 a 80 milioni di READS. Questi analizzano la quantità relativa dei cromosomi ed elaborano uno “score” di rischio per la presenza di una trisomia.

Risultati

L’elaborazione del test prevede l’analisi del RISCHIO associato ad eventuali variazioni numeriche dei cromosomi. Un risultato di BASSO RISCHIO indica che il rischio associato alla variazione numerica di quel dato cromosoma è basso. È bene sottolineare che l’analisi di rischio non permette di assicurare che il feto non presenti tali anomalie dal momento che bisogna considerare che si possono presentare cause dipendenti da caratteristiche legate alla fisiologia placentare/materna.  Viceversa, un risultato di RISCHIO ELEVATO individua un alto rischio che il feto sia affetto da una variazione in numero di quel dato (o di quei) cromosoma. Per gli stessi motivi di cui sopra, tale risultato dovrà essere poi confermato attraverso un esame di approfondimento diagnostico come l’amniocentesi.

Nel referto verrà riportata la concentrazione fetale su cui viene eseguito il test e il sesso del feto, se richiesto. I nostri test sono in grado di fornire il sesso del feto sia su gravidanze singole che gemellari, mono e bicoriali.

In alcuni casi il test può non dare indicazioni per l’analisi richiesta e quindi può non risultare conclusivo. In questi casi, viene richiesto un nuovo campione così da ripetere il test e recuperare il risultato. Tra le possibili cause della mancanza di risultato può esservi la bassa concentrazione di DNA fetale. Tale condizione può essere dovuta ad una serie di fattori, come la precocità dell’epoca gestazionale, condizione di obesità materna, l’assunzione materna di alcuni farmaci, come ad esempio l’assunzione dell’eparina che esercita effetti diretti sui trofoblasti della placenta, riducendone l’apoptosi (Ma GC et al, 2018). Altre cause possono essere discrepanze feto-placentari, malattie autoimmunitarie, deficit di vitamina B12, colestasi intragravidica epatica, leiomiomi uterini (Bianchi DW, 2018). In letteratura è riportato che si può verificare un aumento del rischio di esiti sfavorevoli in gravidanze con ripetuti fallimenti al NIPT (N Chan et al., 2017). Per tale ragione, liddove si verificasse un fallimento del test anche per un’analisi eseguita su un successivo prelievo di sangue (cosa che si può verificare in rari casi) è consigliato ricorrere a metodi diagnostici prenatali, quale l’amniocentesi dal momento che il test di screening non risulta essere idoneo per quella paziente alla comprensione del rischio associato ad eventuali aneuploidie.

 

Rilevanza Clinica Delle Principali Aneuploidie Cromosomiche:

 

	Valore predittivo positivo (PPV)	Valore predittivo negativo (NPV)
Trisomia 21 (Sindrome di Down)	99,21%	>99,99%
Trisomia 18 (Sindrome di Edwards)	99,27%	99,99%
Trisomia 13 (Sindrome di Patau)	>99,99%	>99,99%

 

 

L’alto PPV dei test implica che i risultati di falsi positivi siano ridotti al minimo così come l’alto NPV dei test implica che i risultati di falsi negativi siano ridotti al minimo.

 

Accuratezza dei test

 

I test possiedono un livello di accuratezza molto alto, con percentuali di falsi positivi molto bassi ma non per questo escludibili, data la natura del test che è un test di screening e non un test diagnostico.

 

	Sensibilità	Falsi Negativi	Specificità	Falsi Positivi	Accuratezza
Trisomia 21	>99,99%	<0,001%	99,97%	0,025%	99,98%
Trisomia 18	97,14%	0,014%	99,99%	0,007%	99,98%
Trisomia 13	>99,99%	<0,001%	>99,99%	<0,001%	>99,99%

 

	Sensibilità	Detection Rate
Aneuploidie degli autosomi	>99,99%	>99,99%
Aneuploidie dei cromosomi sessuali	>99,99%	>99,99%

 

 

Per quanto rari, si possono verificare dei FALSI POSITIVI in casi come:

• Mosaicismo Confinato alla Placenta (discrepanza feto-placentare)
• Vanishing Twin
• Aneuploidie a mosaico nella madre
• Anomalie materne di origine iatrogena (presenza di agenti clastogeni, quali farmaci, fattori fisici, virali)
• Tumore materno e metastasi
• CNVs materne

È necessaria per questa ragione la consulenza informativa pre-test con cui la gestante viene messa al corrente di tutte le eventualità e soprattutto vengono raccolte le informazioni necessarie per l’elaborazione. Da considerare, ad esempio, che in caso di gravidanza iniziata come gemellare ed esitata in gravidanza singola, l’analisi viene condotta come una gravidanza gemellare dato che una certa quantità di DNA del feto venuto a mancare può essere ancora nel circolo fetale materno e potrebbe alterare il risultato.

È da considerarsi anche la possibilità di FALSI NEGATIVI, condizione che può verificarsi in alcuni casi, come ad esempio in caso di mosaicismo con aneuploidia fetale e condizione di assetto cromosomico normale rilevato confinato alla placenta.

Con tale test potrebbero essere rilevate aneuploidie nei cromosomi sessuali presenti nel corredo cromosomico della madre (sia omogenee che a mosaico) che possono interferire con l’accuratezza dei risultati riguardanti i cromosomi sessuali fetali. Per tale motivo, tale test non è indicato alle donne portatrici di aneuploidie cromosomiche.

Discussione a parte merita il discorso sull’accuratezza dell’analisi fatta sulle microdelezioni. Queste sono condizioni rare, in cui vi è un basso valore predittivo positivo e ed un’alta percentuale di falsi positivi (Yatsenko, 2015). Nel rilevamento delle microdelezioni è essenziale considerare l’algoritmo utilizzato per il calcolo e gli eventuali problemi biologici che possono determinare una analisi non accurata, come ad esempio le CNV materne. Inoltre, bisogna considerare che se venisse riscontrata una microdelezione, tale rischio deve essere poi indagato con tecniche diagnostiche come Array CGH o FISH. Tale situazione si accompagna a delle problematiche tecniche, ad esempio la FISH può non coprire tutta l’estensione diversa dalla “classica” microdelezione, può non coprire eventuali cromosomi derivativi e si possono avere pazienti con delezioni diverse dalle canoniche. Tutto ciò provoca un grande limite per l’analisi delle microdelezioni.

BIBLIOGRAFIA

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The IONA® test for first-trimester detection of trisomy 21, 18 and 13. Poon LC, Dumidrascu-Diris D, Francisco C, Fantasia I, Nicolaides KH. Ultrasound Obstet Gynecol. 2015 Dec 28

The IONA® Test: Development of an Automated Cell-Free DNA-Based Screening Test for Fetal Trisomies 13, 18, and 21 That Employs the Ion Proton Semiconductor Sequencing Platform. Crea F, Forman M, Hulme R, Old R.W, Ryan D, Mazey R, Risley M.D. Fetal Diagnosis and Therapy. 2017 Feb 8.

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Cherchez la femme: maternal incidental findings can explain discordant prenatal cell-free DNA sequencing results. Bianchi DW. Genet Med. 2018 Sep;20(9):910-917.

Implications of failure to achieve a result from prenatal maternal serum cell-free DNA testing: a historical cohort study. Chan N, Smet ME, Sandow R, da Silva Costa F, McLennan A. BJOG. 2018 Jun;125(7):848-855.

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